白菜官网李剑峰教授团队开发出高效人工转录激活系统dCas9-TV

近日，白菜官网李剑峰教授团队在Nature Plants在线发表了题为“A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells”的研究论文。该研究开发了一种高效的人工转录激活系统dCas9-TV，可在植物中实现高效的靶向基因激活。另外，值得一提的是，李剑峰教授与哈佛医学院、马萨诸塞州总医院Jen Sheen教授是首批在植物细胞中成功实现CRISPR／Cas9介导的基因编辑的研究团队之一，相关论文2013年发表于Nature Biotechnology（Li et al., Nat. Biotechnol., 2013, pp 688-691）。

靶向基因激活工具不仅是基础研究中通过获得性状（gain-of-function）研究基因功能的利器，也是上调作物基因表达从而获得有益农艺性状的手段，并且对植物合成生物学中人工改造植物代谢通路具有重要意义。目前使用来自花椰菜马赛克病毒的35S启动子虽然可以组成型激活植物基因的表达，但在多基因激活时，由于克隆基因表达框的工作量增加，双源载体运载基因数量的限制，转基因沉默以及不同转基因的基因表达差异，运用较为不便。包含DNA结合结构域和转录激活结构域的人工转录激活因子可以通过结合靶基因的启动子，从植物基因组上对基因进行原位激活，而由向导RNA介导的核酸酶失活的Cas9蛋白（dCas9）则是非常理想的可编辑DNA结合特异性的DNA结合平台。早期研究中将dCas9与来自人类疱疹病毒的VP64转录激活结构域融合而获得的dCas9-VP64在动植物细胞中仅能微弱地激活基因表达。虽然目前动物细胞中已开发出3种高效的dCas9人工转录激活因子，即dCas9-VPR，SAM和SunTag系统，但植物细胞中尚无类似系统出现。

李剑峰教授团队设计了10种由dCas9-VP64衍生的人工转录激活因子，并利用植物原生质体瞬时表达系统筛选鉴定出其中最为高效的一种，即dCas9-TV。dCas9-TV包含由6个拷贝的黄单胞菌TAL转录激活结构域和2个拷贝的VP64共同组成的复合型转录激活结构域，其基因激活能力远超dCas9-VP64。该系统可在双子叶植物拟南芥，单子叶植物水稻甚至人类胚肾293T细胞中激活单个或多个靶基因的表达，其激活倍数与靶基因的基础表达水平成反比，即靶基因基础表达水平越低，则越容易被dCas9-TV激活。通过激活拟南芥免疫受体RLP23基因，dCas9系统可以强化拟南芥细胞对于低丰度的nlp20免疫信号的免疫应答，表明该系统有能力通过基因激活而重塑细胞生理以及对外界环境的响应。该团队的研究人员还通过转录组分析证明dCas9-TV在全基因组水平具有较好的基因激活特异性。更进一步，通过直接对植物细胞转染体外预组装的dCas9-TV和向导RNA核糖核蛋白复合体，在植物细胞中实现了不依赖于基因克隆的，快速，瞬时而且DNA-free的靶向基因激活。

该工作的共同第一作者为2023白菜网址官网大全博士生黎镇祥和助理研究员张丹丹，李剑峰教授为通讯作者。来自哈佛医学院／马萨诸塞州总医院的Jen Sheen教授和2023白菜网址官网大全的谢伟教授参与了该研究。该工作由国家自然科学基金“优青”项目以及2023白菜网址官网大全“百人计划”项目资助。

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