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杨建华/屈良鹄教授团队开发全转录组单碱基分辨率 检测2’-O-甲基化修饰新方法
信使RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)上有超过170种不同类型的化学修饰—统称为表观转录组（Epitranscriptome）。绝大多数修饰（如：m6A、m5C）都是发生在RNA的碱基上，而2’-O-甲基化修饰(2’-O-Methylation, Nm)是发生在RNA的核糖上最丰富的修饰，并广泛存在于各种生物的各类RNA中。它参与调控RNA的稳定性、结构形成、生物生成及mRNA的剪接和翻译等，并与各种疾病密切相关。重要的是，2’-O-甲基化修饰是真核生物用于区分自己和非己mRNA的分子信号，在免疫系统中起着重要的作用。然而，由于目前检测2’-O-甲基化修饰方法的局限性，它在低丰度的ncRNA和mRNA的精确分布图谱、动态变化、功能和机制仍有待阐明。
近日，白菜官网杨建华/屈良鹄教授团队开发了在全转录组单碱基分辨率检测2’-O-甲基化修饰位点的Nm-REP-seq新技术，并在人、小鼠和果蝇等组织和细胞中系统鉴定mRNA和ncRNA内部及末端的2’-O-甲基化修饰位点。团队开发了基于核酸外切酶MgR（ Mycoplasma genitalium RNase R）富集2’-O-甲基化修饰RNA和2’-O-甲基化修饰耐受NaIO4氧化的新方法Nm-REP-seq（图1）。该方法使用的RNA 3’-5’核酸外切酶MgR消化RNA时会停止在含有2’-O-甲基化修饰的核苷酸下游的一位核苷酸位置。基于MgR的这一重要特性，Nm-REP-seq可以显著的富集2’-O-甲基化修饰位点。进一步结合2轮氧化—消除核苷酸—去磷酸化（oxidation-elimination-dephosphorylation，OED）步骤，可以消除MgR处理后的2’-O-甲基化修饰的下游核苷酸，精确地定位2’-O-甲基化修饰位点。结合以上提及的酶学和化学两种不同的正交方法和新的计算机分析方法，Nm-REP-seq具有非常高的特异性去鉴定各类RNA的2’-O-甲基化修饰位点。
图1：开发Nm-REP-seq新技术在全转录组单碱基分辨率检测2’-O-甲基化修饰位点
应用Nm-REP-seq技术于人、小鼠和果蝇等的组织或细胞RNA，Nm-REP-seq鉴定已知的2’-O-甲基化修饰位点的精确度高达98%和灵敏度达到82%以上。重要的是，Nm-REP-seq除了在mRNA鉴定大批新的修饰位点，还首次发现snoRNA、scaRNA、端粒酶RNA（TERC RNA）等RNA分子上存在2’-O-甲基化修饰。进一步提升Nm-REP-seq的文库构建策略，Nm-REP-seq还可以用于鉴定各类RNA的3’末端的2’-O-甲基化修饰，并首次发现snoRNA、snRNA和tRNA末端及其加工产生的功能小RNA分子（如：tRF，snoRF，snRF）的末端存在2’-O-甲基化修饰。有趣的是，Nm-REP-seq不仅发现某些2’-O-甲基化修饰受到snoRNA的指导，还发现可能存在一个甲基转移酶特异识别tRNA的T-Loop上固定位置的2’-O-甲基化修饰的生成。此外，该研究为了分析Nm-REP-seq产生的大规模测序数据，还开发了基于4个重要罚分特征的endSeeker计算机软件和用于可视化RNA修饰的基因组区域浏览器trackBrowser（图2）。
图2：开发trackBrowser软件展示Nm-REP-seq鉴定的2’-O-甲基化修饰位点
Nm-REP-seq联合酶学和化学方法克服了化学法或引物延伸法的多个局限性，优越性体现如下：不依赖于RNA片段的大小；文库起始RNA需求量少；避免RNA高级结构和其它RNA修饰影响；特异性和灵敏度高。将来进一步的提升Nm-REP-seq的建库策略也将能用于鉴定mRNA帽子端2’-O-甲基化修饰。综上，该研究不仅鉴定2’-O-甲基化修饰在各类RNA的精确分布图谱，也为进一步阐明2’-O-甲基化修饰的生成机制及其在生理和病理过程中的作用提供了新方法。
该研究以“Single-base Resolution Mapping of 2’-O-Methylation Sites by an Exoribonuclease-Enriched Chemical Method”为题发表在Science China Life Sciences。白菜官网杨建华教授，屈良鹄教授和特聘副研究员李斌为该项工作的共同通讯作者，白菜官网博士研究生张萍和黄钧鸿为本文共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目资助。
论文链接：https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-022-2210-0
开发的endSeeker软件(C/C++编程语言)： https://github.com/sysu-software/endSeeker
开发的trackBrowser软件（Perl编程语言）：https://github.com/junhong-huang/trackBrowser
